外泌體是一種小的 (40-100 nm) 細胞外膜囊泡，目前進行外泌體分離的普遍方法是差速離心法。

     應(yīng)用差速離心法和粒徑分析等是細胞外囊泡 (EV) 研究的重要步驟。已知細胞會分泌許多膜囊泡，這些囊泡的大小、分子含量及其形成機制各不相同 具體取決于細胞的類型 和當前狀態(tài)。通常可以辨別出三個主要的 EV 群體：凋亡小體、脫落的囊泡和外泌體  . 凋亡小體是已知較大的囊泡，直徑為 800-5000 nm，由凋亡后細胞的細胞質(zhì)和質(zhì)膜成分組成。脫落的囊泡和外泌體由非凋亡細胞釋放。脫落的囊泡，也稱為“胞外體"或有時稱為“微泡"，是由質(zhì)膜起泡產(chǎn)生的，一般的粒徑尺寸范圍為 (50– 1000 nm)。

   外泌體是內(nèi)吞起源的小 (40–100 nm) 囊泡群。外泌體和脫落的囊泡都含有特定的蛋白質(zhì)組、RNA 和, dsDNA 等。不同的細胞外環(huán)境富含不同類型的細胞外囊泡。即使由相同的細胞類型形成，不同類別的囊泡也具有不同的核酸特征  。

差速離心法的原理

離心管內(nèi)粒子的速度，由三種力（離心力、阿基米德浮力和斯托克斯粘性阻力）的平衡決定，如：

其中g(shù)eff為離心力（加速度），R為旋轉(zhuǎn)半徑，即粒子距旋轉(zhuǎn)軸的距離，ω為旋轉(zhuǎn)角頻率，d為粒子直徑，ρ為質(zhì)量粒子的密度和 ρ solv和 η 分別是介質(zhì)的密度和粘度。

    在固定的離心條件（轉(zhuǎn)速和介質(zhì)成分）下，粒子速度由粒子的形態(tài)和密度決定。密度高于介質(zhì)密度的粒子沿離心力“向下"運動，而比介質(zhì)輕的粒子沿與離心力相反的方向“上浮"。對于相似的密度，較大的粒子遷移得更快。因此，在生物學中，離心主要用于按大小（差速和速率區(qū)帶離心）或按密度（等密度離心）分離不同的物體。在這項研究中，我們專注于使用差速離心按大小進行顆粒分級。

       與等密度和梯度離心相反，差速離心從離心管內(nèi)顆粒的均勻初始分布開始。在開始一輪離心過程中，位于管底部附近的一部分目標小顆粒不可避免地與較大顆粒共同沉淀。這種共沉淀導(dǎo)致較小顆粒的產(chǎn)量降低。然而，選擇大顆粒，起初位于管半月板附近，在開始一輪離心過程中可能沒有足夠的時間到達管底，從而污染最后一個離心步驟產(chǎn)生的小顆粒顆粒。

       顯然，交叉污染的程度取決于不同粒子群的相對沉降速度和離心條件。在被分離的粒子的沉降速度之間存在顯著（數(shù)量級）差異的情況下，可以有效地優(yōu)化差速離心協(xié)議以獲得目標粒子群的高產(chǎn)量和足夠純度。此外，當不同顆粒部分之間的沉降速率僅存在微小差異時，優(yōu)化過程不太成功。在這些情況下，取決于離心條件。

       任何外泌體分離方案旨在獲得產(chǎn)量合理且不受細胞碎片、細胞器和凋亡小體污染的外泌體群體，理想情況下，不含其他類型的細胞外囊泡、蛋白質(zhì)及其聚集體。由于大小差異很大，將外泌體與細胞、細胞碎片和大囊泡分離相對容易。巨大的挑戰(zhàn)是從小的脫落囊泡中純化外泌體，因為它們的大小非常相似。通過差速離心分離這些細胞外囊泡既困難又低效。所以需要根據(jù)轉(zhuǎn)子的特性和要分離的顆粒的特性，來對離心參數(shù)應(yīng)進行調(diào)整。因為離心速度與粒子的旋轉(zhuǎn)半徑成正比，所以離心運動加速。粒子的徑向坐標隨時間t呈指數(shù)增長。

離心機轉(zhuǎn)子的選擇

    使用差速離心法分離外泌體主要需要注意的是轉(zhuǎn)子的選擇。“擺動桶"(SW) 轉(zhuǎn)子和“定角"(FA) 轉(zhuǎn)子， 這些轉(zhuǎn)子的幾何形狀根本不同，因此沉降特性也不同。這些轉(zhuǎn)子之間的主要區(qū)別在于： FA 轉(zhuǎn)子，與旋轉(zhuǎn)半徑相比，沉積顆粒的較大路徑長度通常較小，允許近似恒定遷移率并簡化描述。然而，第二個區(qū)別是圓形 FA 管的水平橫截面是橢圓形的，不同粒子的路徑長度根據(jù)軌跡與橢圓長軸的距離而不同。由于較短的路徑長度，外圍顆粒可能沉降得更快，需要根據(jù)不同的實驗需要進行選擇。

蘇州阿爾法生物提供的超速離心機、低速離心機、落地式離心機、臺式離心機、納米粒徑分析儀廣泛應(yīng)用于差速離心法分離外泌體及外泌體形態(tài)、電位、粒徑分析等實驗。