1977年Sanger和Gilbert分別提出雙脫氧鏈終止法和化學(xué)降解法測序法，標(biāo)志著初代測序技術(shù)的誕生。

 
初代測序技術(shù)分類
 
Maxam-Gilbert化學(xué)降解法測序
 
1. 測序原理：先對DNA片段的5'或3'端進(jìn)行放射性標(biāo)記，再采用特異性化學(xué)試劑修飾和裂解特定的堿基位點(diǎn)，從而得到一系列有共同放射起點(diǎn)但長度不一的DNA片段混合物，通過對此混合物進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電泳即可從放射自顯影片直接讀出DNA堿基序列。
 
2. 堿基序列的識讀：聚丙烯酰胺凝膠電泳可以將DNA片段混合物按片段大小分開，片段越小越接近凝膠底部。因?yàn)榛瘜W(xué)降解反應(yīng)并非絕對的堿基特異性反應(yīng)，在識讀時(shí)需從A+G泳道中扣除G泳道的條帶而推斷A堿基，從C+T泳道中扣除C泳道的條帶而推斷T堿基，即若A+G泳道中出現(xiàn)一條帶且G泳道中有相同大小的帶，則識讀為G堿基，若G泳道中沒有相同大小的帶，則識讀為A堿基。^[1]
 
 
圖1 化學(xué)降解法測序反應(yīng)示意圖
在不同點(diǎn)切割相同的DNA標(biāo)記片段會產(chǎn)生不同大小的標(biāo)記片段，然后通過凝膠電泳分離片段
 
但由于化學(xué)降解法測序技術(shù)對待測DNA要求較高、操作繁瑣、試劑毒性大、放射性標(biāo)記率偏低等原因，并未得到廣泛應(yīng)用。
 
Sanger雙脫氧鏈終止法測序
 
1. 測序原理：以待測單鏈DNA為模板，在引物的引導(dǎo)下依據(jù)堿基互補(bǔ)配對的原則，隨機(jī)引入底物：4種dNTP(dATP、dTTP、dCTP、dGTP)和4種ddNTP(ddATP、ddTTP、ddCTP、ddGTP)。在DNA聚合酶的作用下，若引入dNTP則新生鏈繼續(xù)延伸，若引入ddNTP則新生鏈合成終止。因此反應(yīng)結(jié)束后體系中得到一系列長度不一的DNA片段混合物，通過電泳對此混合物按分子量大小分開即可讀出DNA堿基序列。
 
 
圖2 傳統(tǒng)（a） VS 改進(jìn)后（b）Sanger法測序原理示意圖
 
傳統(tǒng)Sanger測序采用放射性核素標(biāo)記引物，分成4管反應(yīng)體系，通過平板聚丙烯凝膠電泳對PCR產(chǎn)物進(jìn)行分離。而改進(jìn)后的Sanger測序采用熒光素標(biāo)記標(biāo)記ddNTP或標(biāo)記引物，熒光素標(biāo)記ddNTP時(shí)可實(shí)現(xiàn)4管反應(yīng)在同一管中進(jìn)行，通過毛細(xì)管電泳對PCR產(chǎn)物進(jìn)行分離。
 
2. 堿基序列的識讀：通過電泳將DNA片段混合物按片段大小分開，傳統(tǒng)Sanger測序利用放射自顯影技術(shù)，人工讀取結(jié)果：片段越小越接近凝膠底部，由底部向上依次讀出新合成鏈的5'→3'方向的DNA堿基序列。
 
而改進(jìn)后的Sanger測序利用熒光信號采集技術(shù)，自動化讀取結(jié)果：片段越小越先通過熒光信號采集器，由通過時(shí)間的先后和熒光信號自動記錄堿基序列。
 
 
初代測序技術(shù)特點(diǎn)及應(yīng)用
 
Sanger測序法自面世以來經(jīng)過40年的不斷發(fā)展，讀長可達(dá)1000bp，測序準(zhǔn)確度高達(dá)99%，是基因序列測定的金標(biāo)準(zhǔn)^[2]。但此法的局限在于：只適合對已知突變位點(diǎn)進(jìn)行檢測且只能測出部分變異形式，如檢測點(diǎn)突變、小片段插入/缺失；通量低，導(dǎo)致需要獲得大量信息的成本較高；靈敏度較低，對于腫瘤樣本突變率低于10~15%的變異，檢出難度較大^[3]。
 
隨著精準(zhǔn)時(shí)代的到來，Sanger測序法仍在qPCR檢測和高通量測序技術(shù)的結(jié)果驗(yàn)證、鑒定、微生物種類鑒定和科研等各個(gè)方向發(fā)揮著重要作用。Sanger測序法為我們打開了合成測序的大門，同時(shí)為大規(guī)模基因組測序的誕生奠定了基礎(chǔ)。
      蘇州阿爾法生物實(shí)驗(yàn)器材有限公司提供的基因測序儀、凝膠成像儀、電泳儀、電泳槽、PCR擴(kuò)增儀等廣泛應(yīng)用于初代測序。