HE染色實驗常見問題及解決方案

    HE染色是石蠟切片技術中常用的染色方法之一，簡稱為蘇木精-伊紅染色法。該方法使用堿性的蘇木精染液將細胞核內的染色質和胞質內的核酸染成紫藍色，同時使用酸性染料伊紅將細胞質和細胞外基質中的成分染成紅色。
 
1、切片出現白色斑點
原因：(1) 烘片溫度過低，導致玻片未干透；(2) 切片在二甲苯中停留時間過短；(3) 二甲苯使用時間過長，導致脫蠟不效果不好。
對策：若玻片未干透，先用無水乙醇去除水分，再重新脫蠟。若斑點是由于停留時間過短或使用時間過長造成的，則需重新操作，延長停留時間或更換二甲苯。
 
2、細胞核染色暗淡
原因：(1) 切片在蘇木精染色液中停留時間太短；(2) 蘇木精染色液過度氧化；(3) 分化步驟時間過長；(4) 骨組織脫鈣過度。
對策：重新染色，若固定時間過長導致染色能力減弱，需延長蘇木精染色液停留時間或采用增加組織嗜堿性的方法。
 
3、細胞核過染
原因：(1) 切片在蘇木精染色液中停留時間過長；(2) 切片過厚；(3) 分化步驟時間過短。
對策：若非切片過厚導致，重新染色并適當調整染色和分化時間。若是切片過厚，需重新切片。
 
4、細胞核呈紅、棕色改變
原因：蘇木精染色液過度氧化或切片返藍不足。
對策：檢查蘇木精染色液的染色能力，及時更換過度氧化的液體。在蘇木精染色后，用流水、溫水或弱堿性溶液如稀氨水、0.2%碳酸氫鈉等進行足夠的藍化處理。
5、伊紅著色淡
原因：（1）伊紅染液的pH值可能大于5；（2）藍化液殘留過多；（3）切片太薄；（4）切片經伊紅染色后在乙醇脫水時間過長。
對策：檢查伊紅染液的pH值，如果必要的話，用乙酸將其調節在4～5之間，從而使伊紅染色色彩艷麗。確保每次藍化步驟完成后，使用的弱堿性溶液被充分洗去，玻片上沒有殘留的弱堿性溶液。檢查切片的厚度。脫水時不要讓切片在低濃度乙醇停留時間過長，因為含水多的低濃度乙醇會將伊紅的顏色分化掉。

6、細胞質過染
原因：（1）伊紅染色液濃度太高，特別是焰紅燃料、四溴四氯熒光素鈉的存在；（2）切片在伊紅染色時間過長；（3）切片在伊紅染色后經乙醇脫水步驟時過的太快，而使乙醇分化伊紅的作用不能產生。
對策：適當稀釋伊紅染色液，減少伊紅染色時間，或者使切片在乙醇脫水等步驟時，停留時間相對均勻。同樣，也要檢查切片的厚度是否合適。

7、切片中出現藍黑色沉淀物
原因：蘇木精染色液中的金屬膜，黏附在玻片上。
對策：每天染色前仔細過濾蘇木精染色液，或建議使用半氧化蘇木精染色液，如Gill蘇木精染色液,可以避免過多的金屬膜產生。

8、顯微鏡下見切片內有大量水珠
原因：切片經梯度乙醇處理后沒有脫水，導致二甲苯透明中性樹膠封固后殘留大量水分。
對策：移去蓋玻片，用二甲苯溶解封固劑如中性樹膠。將切片置入新鮮的無水乙醇中，待切片重新脫水后，用新二甲苯透明，中性樹膠封固。所有用于脫水和透明的液體，在使用一定時間以后，應即時更換。

9、光鏡下切片某些區域難以聚焦
原因：蓋玻片上可能有封固切片的封固劑。
對策：移去蓋玻片，重新用干凈的蓋玻片封片。

10、封固劑從蓋玻片與載玻片之間的縫隙回縮
原因：（1）蓋玻片彎曲或不平整；（2）封固劑含二甲苯過多，稀釋過度。
對策：移去蓋玻片，重新找一張蓋玻片，用干凈的封固劑封片。每天保證盛裝封固劑的容器密封性良好，在封固結束的時候蓋緊蓋子。盡量使用小的容器盛裝封固劑，一旦封固劑太粘稠，就可以廢棄不再使用。

11、切片從脫蠟的二甲苯經過梯度乙醇進入水溶液時，水和玻片呈現乳白色混濁改變
原因：用于脫蠟的二甲苯沒有被乙醇洗干凈。
對策：更換洗滌二甲苯的乙醇液體，把切片重新放回無水乙醇，脫去玻片上的水分。

12、細胞核灰藍
原因：（1）組織處理溫度過高、過熱，在石蠟停留的時間過長；（2）固定時間太短，接下來就直接在高濃度的乙醇中行脫水處理。
對策：理論上來說，加熱處理僅在組織浸蠟步驟才使用，組織不能在熱的蠟液中停留過長時間。如果由于某些原因不能進行下步包埋處理，完成浸蠟處理后的組織，可將組織連同塑料包埋盒一并放置在室溫空氣中，冷卻凝固，以備包埋。待需要包埋時再重新加溫直至石蠟融化即可。組織在處理前必須確保固定良好，脫水最好能從低濃度的乙醇開始。

13、切片中出現類似色素樣的點狀結晶和黑色光滑的細胞核
原因：切片封片前放置在空氣中時間太長，以至于二甲苯揮發切片干燥所致。
對策：移去組織切片上的蓋玻片和封固劑，重新處理。將切片水洗數分鐘，然后重新脫水、透明、封固。封片過程中要保持組織切片的輕度濕潤，盡量不要讓其干燥。
 
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