體外定點突變技術是當前生物學各領域研究中的一種重要實驗手段，是改造、優化基因的便捷方案，是探索啟動子調節位點的有效手段，也是研究蛋白質結構和功能之間的復雜關系的有力工具。

 
   蛋白質的結構決定其功能，二者之間的關系是蛋白質組研究的重點之一。對某個已知基因的特定堿基進行定點改變、缺失或者插入，可以改變對應的氨基酸序列和蛋白質結構，對突變基因的表達產物進行研究有助于人類了解蛋白質結構和功能的關系，探討蛋白質的結構/結構域。
 
CRISPR-Cas9系統的靶向雙鏈斷裂（DSB），基因組通常通過非同源端連接（NHEJ）進行修復，通過插入和缺失誘導基因敲除（Indels）。基因敲入和精確突變的引入可以通過使用供體DNA模板的同源定向修復（HDR）來實現，但其效率通常很低，可通過增加抗性篩選來富集陽性克隆，但獲得純合克隆的概率極低。這阻礙了該技術在臨床應用中的發展。但研究發現使用ssodn作為供體模板時，因為ssodn片段較短，同源定向修復（HDR）獲得純合的概率遠高于DNA模板的同源定向修復。
 
常用的定點突變CRISPR-Cas9系統電轉方法是將 gRNA 和 Cas9 蛋白孵育結合為 RNP，加入ssodn一起電轉到靶細胞中，進行單 sgRNA 切割。實現突變位點周圍基因斷裂。
 
如何快速高效構建自己的基因突變細胞株是很多人關心的問題，我們梳理了3個步驟幫你顯著提高點突變實驗成功率：
（1）切割位點到突變位點的距離；
（2）引入同義突變，防止Cas9-sgRNA的二次切割；
（3）通過優化距離提高純合或者雜合的偏向性。
 
1. 切割位點到突變位點的距離
 
獲得純和點突變細胞株首要標準是切割位點到突變位點的距離，最好不要超過10bp,小于5bp為最佳。突變位點距離切割位點越近越好。
圖片
因為定點突變HDR修復并不需要完整的同源臂作為修復模板，細胞可以僅使用同源臂的一部分用于HDR修復，這使得遠離Cas9-sgRNA切割位點的突變，無法被有效整合進基因組。
 
研究發現，突變整合效率隨著與突變位點到切割位點距離的增加而迅速下降。與切割位點距離10bp整合效率下降約一半，超過30bp則一般無法整合到基因組。
 
因此，我們通常建議突變位點與切割位點的距離不超過10bp，從而保證較高的整合效率。（這個也是Cas9X | 海星生物為什么建議細胞的點突變附近要有合適的gRNA序列）

 
2. 引入同義突變，防止Cas9-sgRNA的二次切割
同義突變是指：同義突變是DNA 片段中有時某個堿基對的突變并不改變所編碼的氨基酸。其原因在于該位置的密碼子突變前后為簡并密碼子。點突變一般采用單鏈寡核苷酸（ssDNA）作為HDR模板，可以通過在PAM位點或者guide區域靠近PAM位點引入突變的方式，顯著降低二次切割的概率。
 
 
如果點突變位點距離PAM位點較遠（＞10bp），通常可以在PAM位點附近引入同義突變，防止二次切割。如果PAM位點或者guide區域不在編碼區域上，無法引入同義突變，該PAM位點或者guide區域不影響外顯子剪切對該基因無影響時可直接引入突變。否則可以通過兩步法進行實驗：第一步，先引入點突變和PAM位點突變，獲得雙突變的陽性克隆；第二步，將PAM位點突變回野生型，獲得僅靶位點突變的陽性克隆。同義突變要選擇突變成此轉錄本被廣泛使用的氨基酸對應密碼子，不要選擇稀有密碼子。
 
3. 通過優化距離提高純合或者雜合的偏向性
有一些課題研究，如阿爾茨海默氏病的研究，是需要用到雜合突變的。而通過優化突變位點與切割位點的距離，可以幫助我們更有效地獲得雜合或者純合的突變克隆。

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