在 CRISPR-Cas9 基因編輯技術中，常用的分子生物學試劑按實驗流程可分為載體構建、gRNA 制備、細胞遞送、編輯檢測、篩選與修復五大核心環節，以下是常用到的生物試劑：

一、載體構建階段

1. 限制性內切酶

作用：切割質粒載體和目的 DNA 片段，用于 gRNA 表達盒或 Cas9 表達載體的組裝。

常用酶：

BsaI：識別非常規回文序列（如 GGTCTC），切割后產生黏性末端，適用于 Golden Gate 克隆法，批量組裝 gRNA 表達單元（尤其適用于 CRISPR 文庫構建）。

EcoRI、HindIII：傳統限制性內切酶，比如百時美的EG15536S常用于質粒線性化（如 pUC19、pSpCas9 載體）。

AgeI、AscI：稀有切點酶，減少載體內部酶切位點干擾，提高克隆效率。

應用場景：載體酶切→目的片段插入→連接反應（需配合 T4 DNA 連接酶）。

2. DNA 連接酶

T4 DNA 連接酶：連接酶切后的載體與 gRNA 片段，形成重組質粒。

Gibson 組裝試劑盒：基于同源重組的無縫克隆技術，無需酶切位點，直接拼接多個 DNA 片段（如 Cas9 表達盒與 gRNA 陣列）。

3. 質粒提取與純化試劑

質粒小提試劑盒（如 Qiagen Miniprep）：從大腸桿菌中提取重組質粒，用于后續轉染或測序驗證。

二、gRNA 設計與制備

1. gRNA 寡核苷酸合成

DNA 寡核苷酸：合成 gRNA 的 crRNA（靶向序列）和 tracrRNA 互補鏈，通常含 20nt 靶向序列 + PAM 鄰近序列（如 NGG）。

磷酸化試劑：如 T4 多核苷酸激酶（PNK），對寡核苷酸 5' 端磷酸化，提高連接效率。

2. 體外轉錄（IVT）試劑

RNA 聚合酶：如 T7 RNA 聚合酶，以 DNA 為模板轉錄 gRNA（需含 T7 啟動子序列），適用于體外合成 sgRNA（單鏈 gRNA）。

RNA 純化試劑盒（如 RNA Clean & Concentrator）：去除轉錄產物中的 DNA 模板和雜質，獲得高純度 sgRNA。

3. 引物與 PCR 試劑

PCR 引物：擴增 gRNA 表達盒（如 U6 啟動子 + gRNA 序列），或用于載體構建中的序列驗證（如菌落 PCR）。

高保真 DNA 聚合酶（如 Q5、KOD）：確保擴增序列無突變，尤其在構建 CRISPR 文庫時避免靶向誤差。

三、細胞遞送與編輯

1. 轉染試劑

脂質體轉染試劑：如 Lipofectamine 3000、JetPrime，將重組質粒或 sgRNA/Cas9 核糖核蛋白（RNP）復合物導入細胞（適用于貼壁細胞，如 HEK293T、HeLa）。

電轉染試劑盒：如 Nucleofector 電轉儀配套試劑，適用于難轉染細胞（原代細胞、免疫細胞）。

病毒包裝試劑：

慢病毒包裝質粒（psPAX2、pMD2.G）：包裝 Cas9/gRNA 載體，感染分裂或非分裂細胞（如神經元）。

AAV 載體系統：含 AAV 反向末端重復序列（ITR）、Cas9 基因，用于體內遞送（需輔助質粒 pAAV-RC、pAAV Helper）。

2. Cas9 蛋白與 RNP 復合物

重組 Cas9 蛋白：如 SpCas9-NLS（核定位信號修飾），與 sgRNA 體外組裝成 RNP，瞬時轉染細胞以降低脫靶風險（避免質粒整合）。

蛋白酶抑制劑：如 PMSF，在蛋白純化過程中保護 Cas9 不被降解。

四、編輯效率檢測

1. PCR 與測序試劑

Taq PCR 試劑盒：擴增編輯位點上下游 DNA，用于 Sanger 測序（檢測 Indels）或 TA 克隆后測序（分析突變頻率）。

高通量測序建庫試劑：如 Illumina TruSeq DNA Kit，對大量樣本進行深度測序，定量脫靶效應。

2. 錯配切割酶

T7E1 核酸酶/ Surveyor 核酸酶：識別編輯后 DNA 雙鏈錯配位點并切割，通過凝膠電泳檢測突變效率（適用于初步篩選）。

3. 熒光定量試劑

qPCR 試劑盒：檢測報告基因（如 GFP）的表達變化，評估基因敲除 / 激活效率（需構建熒光報告載體，如 Cas9-dCas9 融合激活系統）。

五、篩選與修復過程

1. 篩選標記試劑

抗生素：如嘌呤霉素（Puro）、G418（Neomycin），篩選穩定整合 Cas9/gRNA 載體的細胞克隆（需載體攜帶抗性基因）。

流式細胞儀（FACS）：分選表達熒光標記（如 mCherry）的陽性細胞，適用于無抗生素篩選的場景。

2. HDR 供體模板

單鏈寡核苷酸（ssODN）：含同源臂的修復模板，用于精確基因敲入（如點突變修復），需化學合成并經 PAGE 純化。

雙鏈 DNA 質粒：作為 HDR 供體，攜帶大片段外源基因（如熒光蛋白基因），需配合 Cas9 切割誘導同源重組。

3. 堿基編輯相關試劑

脫氨酶融合蛋白：如胞嘧啶脫氨酶（APOBEC1）或腺嘌呤脫氨酶（TadA），與 Cas9n（切口酶）結合，實現單堿基編輯（如 BE3、ABE 系統），無需 DSB 即可完成 C→T 或 A→G 替換。

尿嘧啶糖基化酶抑制劑（UGI）：保護編輯過程中產生的尿嘧啶不被修復，提高堿基編輯效率（常見于胞嘧啶堿基編輯器）。

六、輔助試劑與系統優化

1. 細胞培養試劑

培養基與添加劑：如 DMEM、胎牛血清（FBS），維持細胞狀態；ROCK 抑制劑（Y-27632）提高干細胞轉染后的存活率。

細胞裂解液：如 RIPA 緩沖液，提取細胞蛋白用于 Western blot 檢測 Cas9 表達。

2. 基因編輯工具盒

CRISPR 文庫篩選試劑盒：如 Broad Institute 的 GeCKO 文庫，包含靶向全基因組的 gRNA 陣列，用于功能基因篩選（需配合慢病毒包裝試劑）。

CRISPR 激活 / 抑制系統：dCas9-VPR（激活）或 dCas9-KRAB（抑制）質粒，搭配 sgRNA 實現基因轉錄調控，需啟動子區域靶向 gRNA。

試劑分類與應用流程圖

實驗流程                核心試劑                                  作用

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載體構建              限制性內切酶（BsaI、EcoRI）、T4連接酶        切割/連接gRNA/Cas9載體

gRNA制備             IVT試劑盒（T7聚合酶）、DNA寡核苷酸           合成sgRNA

細胞遞送            轉染試劑（脂質體/電轉）、病毒包裝質粒           導入細胞/體內遞送

編輯檢測            T7E1酶、PCR試劑、測序試劑盒                  評估突變效率與脫靶

篩選修復            抗生素、ssODN供體、堿基編輯器組分            篩選陽性細胞/精確修復

輔助優化            細胞培養基、CRISPR文庫、蛋白酶抑制劑          系統優化與功能擴展

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實驗試劑選擇策略與注意事項：

遞送效率：原代細胞先選電轉或病毒載體，貼壁細胞可用脂質體轉染。

檢測精度需求：初步篩選用 T7E1 酶，精準分析需高通量測序。

修復類型選擇：基因敲除依賴 NHEJ（無需供體），精確編輯需 HDR（需 ssODN/dsDNA 供體）。

安全性考量：RNP 復合物（蛋白 + sgRNA）可減少質粒整合風險，適用于醫學研究。

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