蛋白免疫印跡實驗常見問題原因分析匯總如下：

一、檢測無信號

主要可能由于以下原因導致：

1. 用于檢測的二抗不匹配。解決辦法：需要確定一抗的宿主。

2. 一抗二抗的濃度過低：需要耐心地重新實驗。

3.一抗不識別被檢測物種中的蛋白質：可以再檢查以下一抗的特異性。

4.凝膠上上樣的蛋白量太少：凝膠上樣品過少也會導致信號弱，所以適當增加樣本量也可以防止此現象發生。

5.傳輸效率相當低：出現這種情況可以嘗試修改轉移程序的操作，確保 PVDF 與甲醇預孵育。轉移后干燥 PVDF 以確保蛋白質與疏水膜的結合。

6.一抗使用次數過多：億康如果過度稀釋對信號檢測也會有一定的影響，所以盡量使用新稀釋的一抗。

7.阻塞時間過長或洗滌次數過多：盡量減少阻塞時間和洗滌時間。

8. 檢測試劑盒不起作用：這種情況出現的較少，實驗中注意試劑盒的有效期是否正常，也可使用陽性對照并確保檢測試劑盒正常工作。

9.NaN可能會抑制二抗：盡量避免在稀釋緩沖液中使用NaN。

10.一抗或二抗的孵育時間太短：可適當延長孵化時間

11. SDS 上樣緩沖液和樣品裂解液沒有充分混合或者混合不均勻： SDS 上樣緩沖液需要隨用隨配，以保證其新鮮度，另外緩沖液與裂解液可以使用渦旋混合器進行充分混合。

二、無蛋白質的區域具有高背景

蛋白免疫印跡常見問題中出現這種現象，可能由于以下幾種情況所導致。

1.可能由于封閉時間過短或封閉緩沖液使用不當。大多數一抗基本不會和白蛋白或酪蛋白發生交叉反應。如果任何沒有蛋白質的區域具有高背景，則封閉步驟可能無法正常工作。

2.一抗或二抗的濃度過高所致：適當降低抗體濃度。

3.洗滌不夠充分：可以增加洗滌的次數。

4.孵化溫度過高：一抗的孵育溫度以4°C左右為宜。

5.轉印膜選用不當，或者轉印膜干燥：一般情況下選用PVDF膜具有較好的轉印效果，同時防止膜干燥。

6.較高分子量的高背景也有可能是由于還原試劑、SDS或樣品加熱方式時長不正確。

三、出現白帶或信號迅速減弱

1.一抗或二抗過高：適當降低抗體濃度

2.ECL 溶液被污染：注意保持ECL 溶液新鮮程度，或者使用新配制的 ECL 溶液。

3.混合后的 ECL 溶液壽命縮短：注意選擇合適的ECL 解決方案。

四、斷帶、特殊條帶出現

凝膠電泳期間使用的電壓過高或緩沖液溫度過高會出現這種情況。

五、出現漫反射帶

1.抗體濃度過高：適當降低抗體濃度。

2.凝膠上上樣的蛋白質量太高：盡量減少上樣量。

六、出現空白區域

這種情況多數是由于轉移不均勻所造成。轉移時需要確保膜在凝膠上均勻無氣泡。

七、非特異性信號

有的時候高濃度的抗體也導致非特異性信號出現。內源性免疫球蛋白，尤其是在組織裂解物中 容易出現信號干擾。可以通過預先清除內源性免疫球蛋白來減少來自內源性免疫球蛋白的非特異性信號。

八、條帶模糊或者出現污斑

這多數由于凝膠平衡時間不足或凝膠與膜接觸不均勻所致。